細(xì)胞增殖-MTT法實(shí)驗

實(shí)驗原理

MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽)是一種黃色水溶性化合物，可被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為藍(lán)紫色不溶性甲臜(Formazan)結(jié)晶2。甲臜結(jié)晶量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過DMSO溶解后可用酶標(biāo)儀測定吸光度值，間接反映細(xì)胞增殖狀態(tài)。

實(shí)驗材料

• ?細(xì)胞樣本?：對數(shù)生長期細(xì)胞(推薦70-80%融合度)
  

• ?主要試劑?：

• MTT溶液(5mg/mL，PBS配制)
  

• DMSO(分析純)
  

• 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)
  

• ?儀器設(shè)備?：

• 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板
  

• CO?培養(yǎng)箱
  

• 酶標(biāo)儀(檢測波長490nm)
  

實(shí)驗步驟

細(xì)胞接種

1. 消化收集對數(shù)期細(xì)胞，血球計數(shù)板計數(shù)
   

2. 96孔板每孔接種100μL細(xì)胞懸液(密度1×103-1×10?個/孔)
   

3. 邊緣孔用無菌PBS填充減少蒸發(fā)干擾
   

藥物處理

1. 細(xì)胞貼壁后(通常24小時)，加入不同濃度待測藥物
   

2. 每個濃度設(shè)3-5個復(fù)孔
   

3. 37℃、5% CO?繼續(xù)培養(yǎng)12-48小時
   

MTT染色

1. 每孔加入10μL MTT溶液(終濃度0.5mg/mL)
   

2. 繼續(xù)培養(yǎng)4小時
   

3. 小心吸棄上清(懸浮細(xì)胞需先離心)
   

甲臜溶解

1. 每孔加入100-150μL DMSO
   

2. 低速振蕩10分鐘使結(jié)晶充分溶解
   

檢測分析

1. 酶標(biāo)儀490nm波長測定各孔OD值
   

2. 計算抑制率：[(對照組OD-實(shí)驗組OD)/對照組OD]×100%
   

關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化

• ?細(xì)胞接種數(shù)?：根據(jù)增殖速度調(diào)整(快速增殖細(xì)胞可減少至1×103個/孔)
  

• ?MTT反應(yīng)時間?：2-4小時(時間過長易產(chǎn)生毒性)

• ?檢測范圍?：OD值控制在0-0.7之間保證線性關(guān)系

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